SepaBean™ — cистемы
флэш-хроматографии
Santai Technologies

Santai Technologies — технологическая компания, основанная в 2004 году в Китае и занимающаяся разработкой приборов и услуг по разделению и очистке для профессионалов и ученых в области фармацевтики, биотехнологий, тонкой химии, производства натуральных продуктов и нефтехимической промышленности.

Имея более чем 18-летний опыт обслуживания клиентов по всему миру, компания Santai превратилась в одного из ведущих мировых производителей приборов и расходных материалов для флэш-хроматографии.

Флэш-хроматография - это метод химического разделения, используемый для очистки химических смесей. Поскольку это технология очистки, процесс также называют флэш-очисткой.

Независимо от того, синтезируете ли вы новые молекулы или пытаетесь выделить продукт, флэш-хроматография является обязательной частью вашего рабочего процесса. В результате синтетических реакций почти всегда образуются побочные продукты реакции и непрореагировавшие исходные материалы, которые необходимо удалить перед следующим этапом реакции. Если целевое соединение не очищено, то возрастает риск образования еще более нежелательных побочных продуктов при последующих синтезах.

То же самое верно и для исследования натуральных продуктов. При извлечении биомассы или ферментационного бульона извлекается не только целевой компонент, но и другие соединения с аналогичной растворимостью. Удаление / выделение примесей соэкстрагента имеет решающее значение для проведения индивидуального тестирования соединений, которое даст значимые результаты.

Принцип, лежащий в основе этой технологии разделения, прост – соединения в растворе, исходя из их особого химического состава, будут отделяться друг от друга из-за разницы в полярности при соблюдении правильных условий и техники. Эти химические различия основаны на растворимости каждого соединения в определенном растворителе. Соединения с более низкой растворимостью можно отделить от соединений с большей растворимостью, используя тот же растворитель.

В процессе разделения используется колонка, заполненная чистой твердой средой, такой как синтетический диоксид кремния, на которую вводится химическая смесь. После того, как смесь добавлена в верхнюю часть колонки, растворитель вводится в колонку с помощью насоса. Соединения с более высокой растворимостью будут мигрировать через колонку быстрее, чем соединения с меньшей растворимостью, и их можно собирать по отдельности. Собранные материалы будут чище, чем когда они были в исходной неочищенной смеси.

Чтобы выделить нужное вам соединение или соединения из неочищенных смесей, используйте флэш-хроматографию, которая поможет вам достичь этой цели.

Проклятием органического синтеза для большинства химиков является очистка, а не синтез. Синтетические реакционные смеси редко лишены примесей, поэтому необходим определенный тип очистки. Чаще всего используется флэш-хроматография, но для многих химиков она менее понятна, чем их химическая реакция, и вызывает определенный уровень беспокойства.

Пять наиболее важных шагов в созданию успешного метода флэш-хроматографии и, о тревогах, связанных с ним.

В основополагающей статье по адсорбционной флэш-хроматографии, написанной У. Кларком Стиллом в 1978 году (Still, Kahn, & Mitra, 1978), объясняется, как флэш-хроматография при использовании в соответствии с опубликованными рекомендациями обеспечивает быструю (10-15 мин) очистку реакционной смеси для соединений с умеренно высокой степенью разделения (ΔRf ≥ 0,15). За 40 лет, прошедших с момента публикации статьи Стилла, разработка новых методов синтетической органической химии привела к реакциям, которые часто приводят к образованию сложных смесей. Эти реакционные смеси могут быть сложными в очистке, требуя различных методов очистки, таких как градиентное элюирование, и, возможно, даже альтернативных сред для выделения чистого целевого продукта.

Хотя на самом деле универсальных методов хроматографии не существует, есть 5 конкретных научно обоснованных шагов, которым химики должны следовать и понимать, чтобы улучшить свои результаты.

Разберитесь в своем химическом составе. По сути, это означает знание совместимости / растворимости растворителей вашей смеси и возможной реакционной способности целевой молекулы по отношению к кремнезему или другим средам. Вы не хотите, чтобы ваш целевой компонент вступал в реакцию с другим растворителем или средой для хроматографии (например, органические амины с диоксидом кремния)
Ваш выбор растворителя поможет вам принять следующее решение - использовать ли обычную или обращенно-фазовую очистку, как описано ниже...
Нейтрально-кислотные реакционные смеси, растворимые в органических растворителях низкой и средней полярности, являются вероятными кандидатами для силикагелевых колонок и хроматографии в нормальной фазе.
Растворимые смеси в полярных растворителях (спирты, ацетон, ацетонитрил и т.д.) и те продукты реакции, которые являются ионными / ионизируемыми, вероятно, требуют обращенно-фазовой флэш-хроматографии

Органические растворимые вторичные, третичные и гетероциклические амины лучше всего разделять и очищать с помощью аминофункциональных сред.
Потратьте некоторое время на разработку подходящего метода очистки. При нормально-фазовой флэш-очистке, включая те, которые требуют амино-функционализированных сред, тонкослойная хроматография (ТСХ) почти всегда является хорошим выбором для начала. ТСХ позволяет вам оценить различные растворители и смеси растворителей, чтобы найти те, которые обеспечивают наилучшее разделение вашей целевой молекулы от побочных продуктов реакции. Для методов с обращенной фазой разработка метода может быть выполнена с использованием ВЭЖХ или флэш-колонки с обращенной фазой (они многоразовые)
Еще больше оптимизируйте свой метод, учитывая ступенчатый градиент. Ступенчатые градиенты могут повысить пропускную способность колонки (загрузка образца / пропускная способность) при одновременном сокращении расхода растворителя и времени очистки. Два цикла ТСХ с использованием одних и тех же растворителей, но в разных соотношениях позволят разработать масштабируемые методы очистки
Масштабирование линейным методом. Хотя большинство химиков не заботятся о расширении масштабов очистки, те, кто работает на крупномасштабных установках, будут и могут использовать ваш метод в качестве отправной точки. Успешные методы мелкомасштабной (мг или г) очистки масштабируются на основе соотношения размеров колонок, но не на скорости потока. Для этого линейная скорость должна быть равной (или близкой). По-прежнему рекомендуется использовать линейную скорость ~ 5 см / мин. Вы можете посчитать это немного медленным, особенно при использовании среды с более мелкими частицами. Ключ к масштабированию — поддерживать тот же метод элюирования и % загрузки (выраженный в граммах очищенного материала на граммы среды) при регулировке скорости потока для поддержания линейной скорости на более крупных флэш-колонках.

1. Выбор растворителя – влияет на селективность и кинетику массопереноса. Селективность – это мера степени разделения между соединениями. Массоперенос – это скорость, с которой соединения адсорбируются и десорбируются из неподвижной фазы силикагеля (скорость разделения в обращенно-фазовой флэш-хроматографии). Растворители, которые вы выбираете для флэш-очистки, могут обеспечивать хорошую селективность, но могут быть плохими «десорберами», проявляясь в виде широких или размытых хроматографических пиков. Выбирайте растворители для флэш-хроматографии на основе того, насколько хорошо они разделяют компоненты на ТСХ, как по разрешению, так и по форме пятна.

Например, если вы получаете хорошее разделение ТСХ с гексаном/этилацетатом, но одно или несколько пятен имеют хвост, полосу или широкие/перекрываются, как при классическом разделении в виде восьмерки, попробуйте заменить этилацетат на ацетон в той же концентрации. Почему ацетон? Потому что ацетон и этилацетат имеют одинаковую селективность (VIa) и схожие силы, 0,56 и 0,58 соответственно, и поэтому обычно могут заменять друг друга.

2. Размер частиц – влияет на эффективность или количество тарелок, что в свою очередь влияет на разрешение. Эффективность – это мера величины расширения полосы, которая происходит, когда соединение проходит через колонку или картридж. Более эффективные колонки с более мелкими частицами обеспечивают более узкие полосы элюирования (пики) и, следовательно, увеличивают разделение между любой парой или группой соединений, предполагая, что у вас есть селективность. Увеличение разрешения увеличивает чистоту любого очищаемого соединения – или – позволяет увеличить загрузку.

3. Площадь поверхности носителя — напрямую влияет на емкость загрузки образца; больше площадь поверхности = больше емкость загрузки. Просто. Это еще одна переменная, находящаяся под вашим контролем, но может потребовать некоторых исследований, поскольку некоторые поставщики флэш-картриджей не публикуют эти данные. Силикагелевые картриджи с большой площадью поверхности позволяют вам уменьшить размер картриджа, чтобы очистить то же количество материала за меньшее время и с меньшим количеством растворителя.

4. Химия среды – влияет на селективность и кинетику массопереноса. Аналогично выбору растворителя, что имеет смысл, поскольку и растворитель, и среда взаимодействуют с соединениями, перемещающимися через колонку. Большинство химиков используют силикагель, но для некоторых типов молекул, например, основных органических аминов, это может быть не лучшим выбором.

5. Растворитель для растворения (растворитель образца для инъекции) – влияет на многие области флэш-хроматографии, включая эффективность, удерживание, селективность, разрешение. Слишком сильный растворитель для растворения и плохая хроматография являются результатом. Метанол как растворитель для растворения в нормально-фазовой флэш-хроматографии, даже в небольших количествах, может помешать вашей очистке, поскольку он предпочтительно адсорбируется на силикагеле по сравнению с большинством органических соединений и мешает их кинетике массопереноса. Выберите хроматографически слабый растворитель, максимизируйте концентрацию вашей сырой нефти, растворенной в нем, чтобы вы могли минимизировать объем инъекции. Другой вариант – сухая загрузка образца путем абсорбции его на силикагеле или другом инертном сорбенте.

6. Скорость потока – влияет на время очистки, эффективность и кинетику массопереноса. Для каждого размера картриджа и размера частиц носителя существует оптимальная скорость потока или линейная скорость. Слишком медленный или слишком быстрый насос приведет к снижению эффективности разделения. Однако для флэш-очистки, где время имеет значение, работа с немного более быстрым потоком, чем оптимальный, может ускорить время очистки без существенного снижения качества очистки, но есть ограничения.

Итак, что же оптимально? Меньшие размеры частиц позволяют использовать более высокие линейные скорости и, следовательно, более высокие скорости потока. Из опыта, линейная скорость от 3 см/мин (~0,5 мм/сек) до 12 см/мин (~2 мм/сек) обеспечивает наилучшее разделение с частицами кремнезема размером 25 мкм. Для более крупных частиц, прим., 50 мкм, оптимальная линейная скорость ниже, от 2 см/мин (~0,35 мм/сек) до 4,4 см/мин (0,7 мм/сек).

Все перечисленные переменные находятся под вашим контролем. Поэтому знайте свою цель очистки и определите, какие среды, растворители для элюирования, растворители для растворения и скорости потока помогут вам ее достичь.

Если вы используете автоматизированную флэш-хроматографию, у вас может быть система, к которой можно подключить четыре растворителя. Фактически, большинство систем флэш-хроматографии разработаны для использования до четырех растворителей, хотя возможна только очистка с помощью бинарного градиента. Основная причина выбора из четырех растворителей заключается в возможности быстрого создания различных градиентов нормальной фазы и даже обращенной фазы.

Однако бывают случаи, когда полезно добавить третий или даже четвертый растворитель в ваш метод очистки. К ним относятся...

1. Одно или несколько соединений в вашей сырой нефти заряжены или ионизированы в растворе. Хроматография этих соединений приводит к появлению выступающих, расщепленных и / или широких пиков. Такая ситуация может снизить эффективность разделения, пропускную способность, чистоту продукта и даже выход продукта.

2. Ваша смесь содержит как полярные, так и неполярные молекулы, которые не разделяются с использованием двух растворителей и одной колонки. Эти смеси требуют многократной очистки для выделения одного или нескольких соединений в смеси.

В случае ионных или ионизируемых соединений большинство химиков предварительно смешивают кислоту, основание или буфер с чистыми растворителями и запускают бинарный градиент. Хотя это работает, требуется время для подготовки каждого растворителя. Это не такая уж большая проблема, за исключением того, что в итоге у вас остается два дополнительных контейнера с растворителем, которые нужно либо пометить датой, либо сохранить, либо утилизировать после завершения очистки. Если у вас есть флэш-система, способная одновременно перекачивать три растворителя, то вы можете приготовить «запасной» раствор модификатора и использовать его вместо того, чтобы готовить отдельные бутылки с модифицированными растворителями.

Существует ситуация, когда вам понадобится градиент от A до B и далее до C. Необходимость в этом типе градиента возникает в случае, когда в сырой смеси присутствуют соединения с широким диапазоном полярности.

В заключение, возможность включения третьего растворителя в метод полезна при очистке как ионизируемых, так и широкополярных смесей. Попробуйте включить третий растворитель в ваши очистки.

Флэш-хроматография – инструмент очистки как для химиков-органиков, так и для исследователей природных продуктов. Этот инструмент необходим, когда вам нужно удалить примеси из целевого продукта или продуктов, чтобы сделать их чистыми. Чтобы сократить расходы, связанные с флэш-хроматографией, некоторые химики пытаются повторно использовать одну и ту же колонку снова и снова, но не всегда с успехом.

«Сколько раз я могу повторно использовать свою флэш-колонку?»

Повторное использование колонок — это вопрос как экономики, так и химии. При обращенно-фазовой хроматографии повторное использование колонок — это само собой разумеющееся. Почему? Потому что гидрофобная неподвижная фаза промывается органическими растворителями для удаления сильно удерживаемых загрязнений, а колонки можно хранить в ацетонитриле или метаноле в течение длительного времени. Хотя обращенно-фазовые колонки стоят дороже, чем силикагелевые колонки, их повторное использование вскоре окупает разницу в стоимости.

Но как насчет повторного использования нормально-фазовых флэш-колонок? Что ж, нормально-фазовая флэш-хроматография действительно создает некоторые проблемы повторного использования. В отличие от обращенно-фазовых колонок, которые поступают к вам «деактивированными», нормально-фазовые колонки, заполненные сухим силикагелем, являются «активными».

Итак, что значит активный? Ну, как вы знаете, кремний является осушителем, а также хроматографическим сорбентом. Его активная природа позволяет ему адсорбировать воду, среди других растворителей.

Вы когда-нибудь замечали, как нагревается новая сухая колонка с силикагелем при введении растворителя? Это явление называется теплотой адсорбции , и по мере того, как через колонку прокачивается больше растворителя, тепло рассеивается, поскольку силикагель «дезактивируется».

Однако химия растворителя играет роль в количестве происходящей дезактивации. Углеводороды, такие как гексан или гептан, очень неполярны и не генерируют почти столько же тепла или дезактивации, как, скажем, этилацетат или спирт. Большая часть этого экзотермического эффекта смачивания неподвижной фазы связана с полярностью растворителя , как вы можете себе представить, — и именно здесь начинаются проблемы, связанные с повторным использованием.

Чем более полярный органический растворитель, тем более дезактивированным становится силикагель и тем меньше вероятность, что он обеспечит такое же качественное разделение, как и ранее. При использовании полярных растворителей в градиентах с колонками с силикагелем силикагель дезактивируется. Даже при промывке более слабым растворителем активность силикагеля не может быть восстановлена, что приводит к постоянному снижению удерживания и разделения соединений.

После того, как кремний дезактивируется, его практически невозможно повторно активировать. Никакое количество промывки гексаном или другим растворителем не удалит адсорбированный полярный растворитель, независимо от его концентрации.

Есть ли исключения? Конечно, включая запуск изократических методов и использование растворителей с низкой полярностью, таких как дихлорметан. В этих условиях может быть возможным повторное использование вашей силикагелевой колонки.

Итак, ответ на изначальный вопрос — сколько раз я могу повторно использовать свою флэш-колонку — зависит от типа неподвижной фазы и используемых растворителей. В практических целях, чтобы избежать потенциального добавления загрязняющих веществ в последующую очистку нормальной фазы, используйте колонку с силикагелем только один раз — это просто хорошая практика.

Для большинства методов флэш-хроматографии УФ детектор является инструментом обнаружения по умолчанию, поскольку многие соединения поглощают некоторое количество УФ-излучения.

Диодные матричные УФ-детекторы предоставляют химикам возможность выбора длины волны, что позволяет расширять или сужать диапазон длин волн, необходимый для обнаружения определенных соединений и повышения их чувствительности.

Когда детекторы с диодной матрицей не работают, это происходит потому, что соединения не имеют хромофора, например, углеводы, низкие коэффициенты экстинкции, существуют в очень низких концентрациях или в любой комбинации этих факторов. В таких ситуациях альтернативные детекторы весьма полезны.

Позднее были введены УФ-детекторы с переменной длиной волны и выбираемой длиной волны, которые улучшили диапазон обнаружения соединений и чувствительность. Детекторы с настраиваемой диодной матрицей еще больше расширили диапазон обнаруживаемых соединений и чувствительность, что позволило фракционировать многие ранее «невидимые» соединения.

Когда флэш-хроматография появилась несколько десятилетий назад, методы элюирования были в основном изократическими, а сбор фракций был основан на времени или объеме (с использованием объемов колонок). Встроенные УФ-детекторы (монохроматические, 254 нм) были введены с появлением автоматизированной флэш-хроматографии и помогли определить, какие фракции содержат поглощающее УФ-излучение соединение, как это делают многие фармацевтические соединения.

Однако существуют ограничения с УФ, которые требуют других методов обнаружения. В настоящее время для не- и слабо поглощающих соединений используются два альтернативных детектора, в том числе линейное испарительное рассеяние света (ELSD) и линейное масс-детектирование (MS). Эти детекторы «видят» соединения, которые в противном случае невидимы для УФ, что является реальным преимуществом как для химиков органического синтеза, так и для химиков натуральных продуктов.

ELS и масс-детекторы превосходны, когда все соединения образца прозрачны для УФ-излучения и когда в сырой смеси есть смесь УФ-поглощающих и не поглощающих УФ-излучение соединений. Последнее встречается чаще, чем думают большинство химиков.